2025年7月10日，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心、上海脑科学与类脑研究中心刘真研究组、中国科学院脑智卓越中心孙怡迪研究组、临港实验室李昊研究组合作在国际学术期刊Cell 在线发表了题为《Identification and Application of Cell Type-Specific Enhancers for the Macaque Brain》的研究论文，率先建立了灵长类大脑神经细胞类型特异性标记、神经活性调控及观测的工具集，为深入理解灵长类脑结构、脑认知及脑疾病提供了关键技术。

灵长类（猕猴）动物大脑神经细胞类型多样、脑区结构复杂，是解析高等认知功能（如语言、决策、社会行为）的理想模型。解析行为认知背后的神经环路是理解大脑工作原理的关键，而神经环路由不同细胞类型通过复杂联接形成，因此细胞类型特异性靶向技术是脑科学研究领域的重要手段。在啮齿类动物中，经典的Cre转基因小鼠品系可用于实现神经细胞类型特异性的标记、神经活性调控及观测，从而开启了神经环路精细化研究的时代。灵长类动物转基因品系构建周期长、技术难度高、资源投入大，因此传统的Cre转基因策略有很大的局限性。增强子序列是调控基因特异性表达的关键元件，利用特定的增强子可以驱动外源基因在对应细胞类型中的表达。然而，迄今为止，灵长类大脑神经细胞类型特异性增强子的研究尚处于起步阶段，建立能够特异性靶向灵长类大脑不同细胞类型的增强子工具集是该领域的重大需求。

研究团队获得了猕猴全脑单细胞转录组（SnRNA-seq）、空间转录组（Stereo-seq）及单细胞表观组（ATAC-seq）的数据。通过多组学联合分析，研究团队建立了猕猴大脑细胞特异性增强子分析和预测流程，并获得了猕猴不同神经细胞类型的一批潜在侯选增强子序列。针对灵长类大脑不同兴奋性神经元、抑制性神经元和胶质细胞，研究团队设计和构建了利用增强子靶向上述细胞类型的109种荧光报告载体，并分别包装为腺相关（AAV）病毒。为了鉴定真正高效特异的增强子序列，研究团队建立了猕猴大脑通量AAV病毒注射和筛选流程，并利用免疫荧光、单细胞测序、RNA Scope、CO染色、形态学分析等手段对109种AAV病毒的表达效率和靶向特异性进行了系统评估，最终得到能够特异性靶向猕猴不同层兴奋性神经元（L2/3、L4、L5、L6）、抑制性神经元亚型（PV、SST、VIP）及胶质细胞亚型（星形胶质细胞、少突胶质细胞）的增强子序列（图1-1）。跨物种比较显示部分猕猴增强子具有跨物种序列保守性与功能保守性（可在小鼠中靶向标记抑制性神经元及胶质细胞）。然而，针对猕猴皮层不同层兴奋性神经元的增强子在小鼠中未能实现同等效力的靶向标记，这表明大脑顺式调控元件存在进化差异。这一结果也提示，研究团队发现的这些增强子元件更可能在人类中发挥相似的靶向功能，具有潜在临床价值。此外，研究团队还开发了基于重组酶（FRT/Flpo）的双增强子正交策略，进一步提升了增强子标记策略的特异性和灵活性（图1-2）。

基于上述研究，团队在猕猴初级视觉皮层开展了细胞类型特异性光遗传和钙成像实验，实现了PV神经元的特异性活性调控和SST神经元的特异性活性观测，并初步探究了PV神经元的激活对局部微环路的影响，揭示了SST神经元在不同视觉信息刺激下的发放模式（图1-3）。最后研究团队利用上述特异性增强子构建了包含 112 种 AAV 载体的工具集，该工具集支持在灵长类动物中实现9种主要细胞类型的特异性标记、结构解析、靶向活性操纵与动态观测（图1-4）。

图1：灵长类大脑神经细胞类型特异性标记、调控及观测工具集的建立和应用

图1-1：基于猕猴大脑多组学数据增强子预测及在体筛选，成功鉴定出一组增强子可以用来特异性靶向大脑9种主要细胞类型的增强子

图1-2：利用重组酶（FRT/FLPo）依赖的正交策略进一步提高了靶向特异性

图1-3：使用增强子-AAV工具在猕猴视觉皮层中实现监测并操控特定细胞活动

图1-4：建立了全面的灵长类大脑神经细胞类型特异性标记、神经活性调控及观测的工具集

该研究聚焦灵长类脑科学研究的迫切需求，利用灵长类脑图谱研究已有的基础，搭建了包含数据处理、基因工程、探针改造、精细颅外科手术、生物工程、行为训练、电生理记录、光遗传调控、钙成像观测的学科交叉团队和研究体系，系统性地建立了灵长类大脑神经细胞类型特异性标记、神经活性调控及观测的工具集。该研究突破了传统转基因策略的局限，为深入探索灵长类脑结构、解析脑认知原理以及未来实现脑疾病的精准靶向治疗提供了完整且强大的分子遗传工具库，是链接脑结构图谱和脑功能图谱的关键桥梁，标志着灵长类脑科学进入了精准细胞类型研究新阶段。

刘真、孙怡迪、李昊为论文的共同通讯作者。研究得到了国家科技创新2030重大项目、科技部重点研发计划、国家自然科学基金、上海市重点专项、临港实验室重点任务、中国科学院上海分院青年攀登计划项目的资助。