2022年8月5日，《PNAS》期刊在线发表了题为《三个不同的Atoh1增强子协同调控声音受体毛细胞发育》的研究论文，该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、神经科学国家重点实验室、上海脑科学与类脑研究中心（上海脑中心）刘志勇研究组与中国科学院遗传与发育生物学研究所、分子发育生物学国家重点实验室陆发隆研究组合作完成。该研究解析了新生小鼠耳蜗毛细胞的全基因组开放染色质图谱，发现和验证了两个之前未知的Atoh1增强子。研究人员利用CRISPR/Cas9技术敲除单个或同时敲除多个Atoh1增强子，揭示了Atoh1的三个增强子以剂量依赖性协同调控毛细胞发育。该项研究结果为Atoh1表达的精准表观遗传学调控机制提供了更深入的理论依据，并为耳蜗毛细胞再生提供了新的潜在靶点。

耳蜗毛细胞是声音的感受器，转录因子Atoh1突变小鼠完全丧失毛细胞，相反，过表达Atoh1能够额外产生更多的毛细胞。Atoh1的重要生物学功能使之成为毛细胞发育再生领域的一个重要的靶点。因此，深入理解Atoh1表达的调控机制有着重要的科学意义。Atoh1在毛细胞发育过程中高度动态变化，但其精准调控机制仍知之甚少。过去20年来，Atoh1增强子1（Eh1）一直被认为对Atoh1的表达至关重要。但这个假说一直并未得到体内实验的证实，而且毛细胞中是否还存在尚未发现的其他Atoh1增强子也未可知。

研究人员首先利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除Eh1，Eh1 -/-小鼠耳蜗毛细胞发育完全正常，这表明Eh1对于毛细胞的发育不是必需的。这个结果和预期的完全相反，提示毛细胞还存在尚未发现的其他Atoh1增强子。随后，研究人员流式分选获得新生小鼠耳蜗毛细胞（图1A），并利用染色质开放性测序技术(ATAC-seq)，建立了毛细胞的全基因组染色质开放图谱,发现了两个位于Atoh1远端的新增强子（Eh2和Eh3）。而且，Eh2和Eh3只在毛细胞中开放，而在对照组（小脑颗粒细胞前体细胞，同样表达Atoh1）中处于关闭状态，提示Eh2和Eh3是毛细胞特异的调控元件（图1B）。随后研究人员构建了转基因小鼠，验证了Eh2和Eh3是特异在毛细胞中活跃的增强子（图1C）。为了进一步探究Eh2和Eh3在毛细胞发育中的功能，研究人员在小鼠中分别敲除Eh2和Eh3，毛细胞发育完全正常或者仅有弱的发育异常。但是同时敲除Eh2和Eh3，毛细胞数量明显减少；进一步发现，同时敲除三个Atoh1增强子使毛细胞数量进一步下降到最低点。正常的耳蜗毛细胞数量约2800个（图1D），敲除Atoh1的三个增强子后，毛细胞数量急剧减少到约86个（图1E），以上实验结果表明Atoh1的三个增强子协同调控毛细胞的形成。

图1耳蜗毛细胞ATAC-seq，增强子验证和功能分析。（A）耳蜗毛细胞流式分选和ATAC-seq示意图。（B）Eh2和Eh3在毛细胞中保持开放，而在对照组中处于关闭状态。（C）转基因小鼠耳蜗染色分析发现Eh3特异驱动毛细胞中EGFP报告基因的表达。（D）正常野生型耳蜗毛细胞。（E）同时敲除Atoh1的三个增强子引起毛细胞数量急剧减少。

最后，研究人员利用CUT&RUN技术，揭示了Atoh1蛋白在耳蜗毛细胞中的全基因组结合位点，发现Atoh1可以直接结合到Eh1，Eh2和Eh3这三个增强子上，从而调控Atoh1自身的表达（图2）。这个结果提供Atoh1的三个增强子被敲除后，Atoh1表达水平显著下降，引起毛细胞数量急剧减少的分子机制。这个研究结果为在成年耳蜗支持细胞内如何重新启动Atoh1的表达提供了理论指导，有助于促进未来成年耳蜗毛细胞再生恢复的研究。

图2Atoh1和三个增强子的调控示意图。在正常毛细胞中，Atoh1蛋白可以直接结合到三个增强子（Eh1，Eh2和Eh3）上，进而促进Atoh1自身的表达。三个增强子被同时敲除，失去了自主调控作用，引起Atoh1表达下降，毛细胞数量减少。

中科院脑智卓越中心刘志勇研究员和中科院遗传发育所陆发隆研究员为该论文的共同通讯作者；脑智卓越中心博士研究生罗正南和遗传发育所博士研究生杜毅为该论文共同第一作者，脑智卓越中心博士研究生李书亭，张迪，王广琴，张赫博士和工作人员贺顺姬对课题做出了重要贡献，遗传发育所舒慕娅博士也给予了重要帮助。该研究得到了中科院脑智卓越中心分子细胞技术平台，光学成像平台以及实验动物平台（实验鼠房）的大力支持。该研究得到科技部，中科院，基金委和上海市的支持。