突触连接的特异性对于大脑中功能性神经环路的形成至关重要，众多细胞粘附分子在该过程中扮演着不可或缺的角色。然而，在微神经环路水平上如何实现突触形成的特异性依然不明朗。

2024年3月12日，临港实验室、中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心、上海脑科学与类脑研究中心联合在eLife在线发表了题为《Combinatorial expression of gamma-protocadherins regulates synaptic connectivity in the mouse neocortex》的研究论文。

该研究主要通过单细胞测序，多通道全细胞膜片钳电生理记录和遗传学手段揭示了含有20余种亚型的原钙粘蛋白(protocadherin, PCDH)家族中的γ-PCDH亚家族在神经环路发育过程中的作用（图1）。

图1：γ-PCDH在突触形成过程中的作用示意图

该研究首先利用5’单细胞测序技术揭示了突触发育早期小鼠新皮层不同细胞中γ-PCDH的表达情况，发现每个细胞都会表达若干种γ-PCDH亚型，而不同细胞的γ-PCDH亚型表达种类组合差异很大。

继而采用遗传学手段在小鼠新皮层的兴奋性神经元中特异性敲除γ-PCDH整个家族，通过多通道膜片钳的方法(图2A)发现γ-PCDH的缺失使得相邻神经元间突触增多，而PCDH另一家族α-PCDH的敲除则没有明显变化(图2B)。而后进一步分析了突触连接率的上升和神经元位置、或小鼠年龄之间的关系，发现与发育进程息息相关。

γ-PCDH亚型的基因群在染色体上的排布极为特殊，同时对多个亚型进行遗传学操作较为困难。该研究通过胚胎电转多个质粒混合物的方法，成功在神经元中同时过表达多种γ-PCDH亚型，并使用了单细胞RT-PCR加以验证(图2D，E)。多通道膜片钳记录揭示了过表达一种或多种相同γ-PCDH(C-type亚型除外)的神经元之间的突触连接率显著下降(图2C)。基因敲除和过表达的结果表明γ-PCDH对相邻神经元间突触连接的形成起抑制作用。

图2：γ-PCDHs敲除或过表达对突触连接率的影响 A：6通道膜片钳记录示意图，其中左侧绿色为电流钳刺激的细胞，右侧为其余未受刺激的细胞的电压钳记录结果。绿色箭头指示了一对双向的突触连接(细胞1和细胞3)，黄色箭头指示了2对单向的突触连接(细胞4到细胞3以及细胞5到细胞6)；B：条件性敲除γ-PCDHs和α-PCDHs对新皮层兴奋性神经元之间突触连接率的影响；C：过表达γ-PCDHs对突触连接率的影响，其中红色为过表达细胞之间的连接率，灰色为一个过表达细胞和另一个非过表达细胞之间的连接率，深灰色为两个未过表达细胞间的连接率，1 isoform对应过表达1种γ-PCDH亚型，6 isoforms对应过表达6种γ-PCDH亚型的组合，Control对应过表达空载体(只携带荧光蛋白)，gC4对应过表达γ-PCDHs中的C-type C4亚型；D：单细胞RT-PCR实验示意图；E：单细胞RT-PCR结果，其中上方的绿色编号表明带有荧光的(过表达)细胞，黑色编号的为不携带荧光的细胞，N1-N6为RT-PCR的阴性对照组。左侧为γ-PCDH的亚型(C-type不包括在内)，绿色为选择过表达的6种。

该研究进一步探索了γ-PCDH不同亚型组合表达在突触形成中的作用。通过在小鼠胚胎期14.5和15.5天连续两次同一位点进行胚胎电转，实现了在两群相邻神经元中表达不同的γ-PCDH不同亚型组合(图3A)。借助这种方法和多通道膜片钳电生理记录(图3B，C)，发现了神经元之间的突触连接率与它们过表达的γ-PCDH亚型组合的相似性高度相关(图3D，E)：两者之间组合的相似度越高，则突触连接形成的概率越低(图1)。

图3：γ-PCDH不同亚型的组合表达对突触连接的影响 A：E14.5，E15.5两次胚胎电转实验示意图；B：实验中所用的4种不同相似度质粒组合，其中E14.5电转的质粒都携带绿色mNeongreen，E15.5携带红色mRuby3。从0%(完全不同)到100%(完全相同)，列表中s.是指E14.5和E15.5电转质粒包含的相同亚型，d.是指E14.5和E15.5两次电转中不同的亚型；C：6通道膜片钳记录上述连续电转的脑片示意图，其中细胞3，4被绿色荧光标记，6被红色荧光标记。所有记录的6个细胞都通过电极内液标记上Neurobiotin (白色)，白色阴影指示了所用记录电极的相对位置。每一次的多通道记录中包含至少1个绿色荧光细胞，至少1个红色荧光细胞和至少1个没有荧光的细胞；D：过表达不同γ-PCDH的组合的细胞对之间的连接率和其对应相似度的关系；E：对D中的数据进行重抽样和相关性分析，表明突触连接率和过表达的γ-PCDH亚型组合的相似度呈现负向线性相关。

新皮层中神经元间的突触形成并非完全随机，突触特异性形成的分子机制的探索将有助于我们更好地理解其生理和病理功能。该研究发现神经环路发育过程中两个神经元表达的γ-PCDH亚型种类对它们之间能否形成突触至关重要：它们表达的γ-PCDH亚型种类越相似越不容易形成突触。这表明γ-PCDH的存在使得新皮层中兴奋型神经元能够选择性避开特定神经元不形成突触，而不是选择与特定神经元形成突触。在此基础上，关于神经元之间是否存在特定的吸引机制以帮助突触的特异性形成仍然是一个未解之谜。

临港实验室徐华泰研究员为该论文的通讯作者；中科院脑科学与智能技术卓越创新中心博士研究生朱益君为该论文的第一作者，博士后邓彩云、助理研究员范柳、研究助理王亚倩、周惠均对此课题有重要贡献。张翼凤研究员、仇子龙研究员、储军研究员、蒲慕明院士以及时松海院士在该研究的探索和成文过程中有很大帮助。

该研究获得科技部重点研发项目、中国科学院先导计划、科技部基金委面上项目、上海市级专项、神经科学国家重点实验室和临港实验室的资助。